细胞培养需要提供合适的温度和气体环境，因此一般采用培养箱的形式来满足细胞培养的要求。

 

细胞培养的具体步骤：

 

1、细胞复苏

 

将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。移人15ml离心管中，加入10ml预热的DMEM*培养基，轻轻吹匀，离心，2000rpmX2min，弃上清液。

 

加入10ml DMEM培养基清洗，弃上清液。加入10ml DMEM*培养基，轻轻吹打，接种于10cm盘中，在含5%CO2的细胞培养箱中培养。

 

2、细胞传代

 

细胞密度达到80%~90%时．去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加人1ml DMEM*培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。

 

加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。再加入10ml PBS（经高压灭菌，保存于40C），吹匀，吸取10微升进行计数，按照1×106/盘接种，在含5%CO2的细胞培养箱继续培养。

 

3、细胞冻存

 

细胞密度达到80%～90%时，去培养基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人细胞培养箱3min。加入lmlDMEM*培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管。加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液。

 

加入lml冻存液（90%血清，10%DMSO），放入冻存盒内（盒内有异丙醇，以保证温度降低的速度），立即放入一80℃冰箱内，过夜，第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放人液氮，可以保存三个月。